Identification and characterization of a late gene encoded by grouper iridovirus 2L (GIV‐2L)

Grouper iridovirus (GIV) belongs to the Ranavirus genus and is one of the most important viral pathogens in grouper, particularly at the fry and fingerling stages. In this study, we identified and characterized the GIV‐2L gene, which encodes a protein of unknown function. GIV‐2L is 1242 bp in length, with a predicted protein mass of 46.2 kDa. It displayed significant identity only with members of the Ranavirus and Iridovirus genera. We produced mouse monoclonal antibodies against the GIV‐2L protein by immunizing mice with GIV‐2L‐His‐tag recombinant protein. By inhibiting de novo protein and DNA synthesis in GIV‐infected cells, we showed that GIV‐2L was a late gene during the viral replication. Finally, immunofluorescence microscopy revealed that GIV‐2L protein accumulated in both the nucleus and cytoplasm of infected cells. These results offer important insights into the pathogenesis of GIV.     

Identification and characterization of a novel lymphocystis disease virus isolate from cultured grouper in China

Grouper Epinephelus spp. is one of the most important mariculture fish species in China and South-East Asian countries. The emerging viral diseases, evoked by iridovirus which belongs to genus Megalocytivirus and Ranavirus, have been well characterized in recent years. To date, few data on lymphocystis disease in grouper which caused by lymphocystis disease virus (LCDV) were described. Here, a novel LCDV isolate was identified and characterized. Based on the sequence of LCDV major capsid protein (MCP) and DNA polymerase gene, we found that the causative agents from different species of diseased groupers were the same one and herein were uniformly defined as grouper LCDV (GLCDV). Furthermore, H&E staining revealed that the nodules on the skin were composed of giant cells that contained inclusion bodies in the cytoplasm. Numerous virus particles with >210 nm in diameter and with hexagonal profiles were observed in the cytoplasm. In addition, phylogenetic analysis based on four iridovirus core genes, MCP, DNA polymerase, myristoylated membrane protein (MMP) and ribonucleotide reductase (RNR), consistently showed that GLCDV was mostly related to LCDV-C, followed by LCDV-1. Taken together, our data firstly provided the molecular evidence that GLCDV was a novel emerging iridovirus pathogen in grouper culture.     

谷氨酰胺对点带石斑鱼免疫细胞免疫力的影响

将从平均体质量400 g的点带石斑鱼中肾分离出的白细胞培养在添加0、0．5、1、2 mmol／L 谷氨酰胺的培养基中2、6、12、24 h后,测定白细胞的吞噬和呼吸爆发活力,结果发现,添加谷氨酰胺后白细胞的吞噬和呼吸爆发活力显著提高,随着培养时间的延长,吞噬和呼吸爆发活力进一步提高,最高值均在培养12 h后的1 mmol／L组。在培养12、24 h后测定了白细胞的增殖能力,发现培养12 h后,添加谷氨酰胺的各组增殖效果明显优于未添加谷氨酰胺组（对照组）（ P＜0．05）,但添加谷氨酰胺的各组之间差异不显著（P＞0．05）,最高值在1 mmol／L组;培养48 h后,除2 mmol／L组外,其他处理组的增殖效果均下降。白细胞对迟钝爱德华氏菌杀菌率变化趋势与吞噬活力相符,1、2 mmol／L 组杀菌率显著高于对照组（P＜0．05）,而0．5 mmol／L组与对照组之间差异不显著（P＞0．05）。试验结果表明,谷氨酰胺是石斑鱼有效的免疫增强剂,在培养基中添加1 mmol／L 谷氨酰胺培养12 h效果最佳。     

大鲵虹彩病毒流行株的分离及其主衣壳蛋白编码基因序列比较分析

大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus, GSIV)是近年中国大陆新发现的引起人工养殖大鲵(Andrias davidianus)大规模死亡的病毒病原。为了揭示大鲵虹彩病毒流行株的基因型差异, 本研究对2010–2012年采集自全国不同大鲵养殖区域的患虹彩病毒病的大鲵样本进行了分子检测、病毒分离培养以及病毒主衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)基因测序与比对分析。结果显示, 采自陕西、湖北、湖南、浙江、江西、福建等省的10个样本检测为阳性, 通过细胞培养获得10株病毒流行株。对该10株流行株MCP基因的测序与比对分析发现, 核苷酸序列相似性达到99.7%~100%, 其推测的氨基酸序列无明显差异, 证实中国大鲵虹彩病毒流行株属同一基因型。系统进化树分析结果表明, 所选大鲵虹彩病毒与蛙病毒分别聚为一枝, 但其亲缘关系较近。本研究结果旨为大鲵虹彩病毒病的疫苗研制及其免疫防控技术研究奠定基础。

     

大鲵感染虹彩病毒的诊断和治疗

2013年7月,陕西省汉中某大鲵养殖场发生以大鲵体表和四肢多处溃烂并伴有出血为特征的疾病,染病大鲵大量死亡。经临床观察、病理解剖及实验室检测,最后确诊病原为大鲵虹彩病毒。通过采取综合防治措施,养殖场大鲵疫情得到有效控制。     

投喂频率对龙虎斑幼鱼生长和饵料利用的影响

在室内车间采用4种不同的投喂频率养殖龙虎斑幼鱼（47．6±5．2 g）,分析和比较不同投喂频率对其生长和饵料利用的影响。试验设S1、S2、S3、S4共4组,分别按照1、2、3、4次/d进行投喂,共进行60 d。结果显示：（1）投喂频率显著影响龙虎斑幼鱼的生长（P＜0．05）。 S1的平均体质量显著低于S2、S3、S4（P＜0．05）,为149．7 g;S2、S3、S4组间差异不显著（P＞0．05）,S4最大（168．7 g）,其次为S3（168．0 g）和S2（162．2 g）;S1日增体质量、增重率、特定生长率显著小于S2、S3、S4（P＜0．05）,分别为1．68 g,204．83％,1．86％/d,S2、S3、S4组间差异不显著（P＞0．05）,S2特定生长率最大,为2．12％/d;S2的体质量回归方程斜率最大,为1．915,S1最小,为1．532。（2）投喂频率对龙虎斑幼鱼的饵料利用影响显著（P＜0．05）。 S2的摄食率和饵料系数显著小于S1、S3、S4（P＜0．05）,分别为1．31％/d、0．70;S4摄食率最大,为1．64％/d;S1、S3、S4组间饵料系数差异不显著（P＞0．05）,分别为0．88、0．84、0．88。因此,综合养殖效果和劳动强度考虑,S2的投喂频率最适合龙虎斑的养殖,建议在龙虎斑的养殖生产中,最适宜的投喂频率为2次/d。     

大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus, GSIV)主要衣壳蛋白(MCP)编码区长度为1 392 bp 的片段, 克隆到 pMD19-T载体上, 构建重组质粒 pMD19-T-MCP。经PCR鉴定确认正确后, 以10倍梯度稀释 pMD19-T-MCP重组质粒, 作为标准模板进行 TaqMan实时荧光定量PCR扩增, 制作标准曲线, 建立了大鲵虹彩病毒的 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。制作的标准曲线有极好的线性关系, 且线性范围宽, 相关系数为0.990 19。组内重复试验的CT值标准偏差为0.52%。检测结果显示, 该方法对大鲵虹彩病毒的检测有高度的特异性, 与锦鲤疱疹病毒、弗氏柠檬酸杆菌、嗜水气单胞菌以及鲤上皮瘤细胞基因组DNA之间均无交叉反应, 特异性好, 检测总DNA灵敏度为10个病毒核酸分子拷贝数, 约1.1×10-3 pg/μL病毒核酸, 较之常规PCR的敏感度高出约1 000倍。研究建立的大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强, 对大鲵虹彩病毒病的快速诊断与病毒病原定量检测有重要意义。     

大鲵虹彩病毒理化及生物学特性研究

对大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus,GSIV)的理化特性及生物学特性进行了研究。结果表明:GSIV对热处理敏感,56℃和65℃处理30 min均可彻底灭活病毒;GSIV经酸(pH3)和碱(pH10)处理,病毒滴度(TCID50)与对照组相比较分别下降了8.58、9.04个对数级,差异极显著(P<0.01);GSIV经有机溶剂氯仿、乙醚以及胰蛋白酶处理,TCID50与对照组相比较分别下降了9.33、7.83、6.49个对数级,差异极显著(P<0.01)。冻融次数对GSIV滴度的影响不显著(P>0.05)。GSIV对细胞培养物的感染性试验结果表明,GSIV可在鲤上皮瘤细胞系(Epithelioma papilloma cyprini,EPC)、斑点叉尾鮰肾脏细胞系(Channel catfish kidney,CCK)、虹鳟鱼性腺细胞系(Rainbow trout gonadal,RTG-2)等细胞中增殖,但在EPC、CCK细胞中增殖速度快,TCID50高;GSIV在EPC细胞中的最适生长温度是25℃。GSIV在EPC细胞中增殖动态试验结果表明,GSIV感染细胞6 h后TCID50开始快速上升,进入对数增长期,72 h时TCID50达到最大值,以后趋于稳定。GSIV感染EPC细胞超薄切片透射电镜观察结果显示,在EPC细胞质中可见大量虹彩病毒样颗粒,呈晶格状排列,直径约140 nm。